ATCC是全球zui quan威的生物資源庫之一，規(guī)范地使用其細(xì)胞系是保證科研數(shù)據(jù)可靠性和可重復(fù)性的基礎(chǔ)。

細(xì)胞的復(fù)蘇

　　核心原則：“慢凍快融"。

　　準(zhǔn)備：提前預(yù)熱完培（含胎牛血清FBS和抗生素，視細(xì)胞需求而定）。準(zhǔn)備好15mL離心管并加入5-9mL預(yù)熱培養(yǎng)基。

　　水浴融化：從液氮罐中取出凍存管，立即投入37°C恒溫水浴鍋中，輕輕搖晃并在1-2分鐘內(nèi)使其wan全融化（留一小塊冰晶未融亦可，以保持細(xì)胞完整性）。

　　離心洗滌（可選但推薦）：將融化的細(xì)胞懸液移入裝有預(yù)熱培養(yǎng)基的離心管中，1000rpm離心3-5分鐘，棄上清（去除DMSO凍存液的毒性），用新鮮培養(yǎng)基重懸。

　　注：對于極其脆弱的細(xì)胞，可不離心，直接將細(xì)胞懸液滴入培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后（約次日）再換液。

　　接種培養(yǎng)：將重懸的細(xì)胞移入培養(yǎng)瓶/皿中，補(bǔ)充至所需體積，十字交叉法輕輕搖勻，放入37°C、5%CO?培養(yǎng)箱中。

日常培養(yǎng)與傳代

　　核心原則：保持細(xì)胞處于對數(shù)生長期，避免過度生長。

　　觀察：每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、密度及是否有污染（細(xì)菌、真菌或支原體）。

　　傳代時(shí)機(jī)：當(dāng)貼壁細(xì)胞達(dá)到80%-90%匯合度，或懸浮細(xì)胞達(dá)到最大推薦密度時(shí)，需進(jìn)行傳代。

　　傳代步驟（以貼壁細(xì)胞為例）：

　　吸棄舊培養(yǎng)基，用無菌PBS洗滌細(xì)胞1-2次（去除血清中的胰酶抑制劑）。

　　加入適量胰蛋白酶-EDTA溶液（剛好覆蓋底面即可），放入培養(yǎng)箱中消化1-5分鐘（視細(xì)胞類型而定）。

　　顯微鏡下觀察到細(xì)胞變圓、邊緣開始脫離器皿時(shí)，輕輕拍打瓶壁使細(xì)胞脫落。

　　加入等量或雙倍的完培（利用血清中和胰酶），吹打底部制成單細(xì)胞懸液。

　　移入離心管離心，棄上清，用新鮮培養(yǎng)基重懸。

　　按ATCC推薦的傳代比例（如1:3,1:5,1:10）接種到新的培養(yǎng)器皿中。

細(xì)胞的凍存

　　核心原則：“慢凍"，避免冰晶損傷細(xì)胞。

　　凍存時(shí)機(jī)：選擇對數(shù)生長期、活力>90%且無污染的細(xì)胞。

　　凍存液配制：通常為90%胎牛血清(FBS)+10%DMSO，或基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%FBS+10%DMSO。注意：DMSO在室溫下對細(xì)胞有毒性，配制后需置于冰上預(yù)冷。

　　操作步驟：

　　按常規(guī)方法消化、離心收集細(xì)胞。

　　用預(yù)冷的凍存液重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10?~5×10?cells/mL。

　　將懸液分裝入無菌凍存管（約1mL/管），擰緊蓋子。

　　使用**程序降溫盒（Mr.Frosty）**放入-80°C冰箱，使其以約-1°C/分鐘的速度緩慢降溫。（若無降溫盒，可采用棉塞包裹凍存管懸掛于液氮罐口法）

　　24小時(shí)后，將凍存管從-80°C轉(zhuǎn)移至**液氮罐（-196°C）**中長期保存，并做好詳細(xì)記錄（細(xì)胞名稱、代次、日期、操作人）。

質(zhì)量控制與常見避坑指南

　　警惕支原體污染：

　　支原體污染不會使培養(yǎng)基變渾濁，但會嚴(yán)重影響細(xì)胞代謝、基因表達(dá)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

　　建議：新收到的細(xì)胞或每隔1-2個(gè)月，定期使用PCR法或DAPI/Hoechst染色法進(jìn)行支原體檢測。

　　切勿過度傳代：

　　正常細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞）存在海弗里克極限，會隨著傳代衰老死亡。

　　腫瘤細(xì)胞雖然“永生"，但長期傳代會導(dǎo)致基因型漂移、形態(tài)改變和藥物敏感性變化。

　　建議：收到ATCC細(xì)胞后，立即進(jìn)行擴(kuò)增并凍存多管“早期代次"的種子庫（MasterCellBank），日常實(shí)驗(yàn)從種子庫復(fù)蘇，傳代控制在20-30代以內(nèi)廢棄。

　　嚴(yán)格遵循培養(yǎng)基配方：

　　不要輕易替換ATCC推薦的培養(yǎng)基。例如，某些細(xì)胞需要特定濃度的丙酮酸鈉、非必需氨基酸或特殊的生長因子。隨意換液可能導(dǎo)致細(xì)胞表型丟失。

　　生物安全：

　　嚴(yán)格按照ATCC標(biāo)注的生物安全等級（BSL-1或BSL-2）在相應(yīng)的生物安全柜內(nèi)操作。

　　涉及人類或靈長類來源的細(xì)胞系，務(wù)必做好防護(hù)并遵守實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)定。

　　規(guī)范使用ATCC細(xì)胞系，不僅能提升實(shí)驗(yàn)的成功率，更是發(fā)表高水平學(xué)術(shù)論文、通過同行評審的基礎(chǔ)保障。